蛋白質測定常用的方法是凱氏定氮法，它是通過測定氮含量從而換算成蛋白質的方法，是上通用的標準方法，其優點為實驗操作簡單、方便，測量結果的重復性和重現性好，而被廣泛應用于各類食品、谷物、飼料等樣品的蛋白質含量測定中。凱氏定氮法分為常量、半微量、微量法三種方法，其原理是食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質的含量。該方法有取樣、樣品消化、蒸餾、滴定四個步驟，其原理較為復雜，使用的試劑也比較多，以下將對這四個步驟進行簡單講述。
1、樣品(pin)的取樣
取樣(yang)(yang)(yang)應(ying)具有代表性，取樣(yang)(yang)(yang)前將樣(yang)(yang)(yang)品充(chong)分混勻，固體試(shi)樣(yang)(yang)(yang)可用粉碎設備制成細小均勻粉末。稱量放入凱氏定氮(dan)瓶(ping)時，切勿使樣(yang)(yang)(yang)品粘附在瓶(ping)頸部，避免樣(yang)(yang)(yang)品未消化而(er)造成氮(dan)損失。
2、樣品的消化
樣品中(zhong)含(han)(han)氮(dan)有機(ji)(ji)化(hua)(hua)(hua)(hua)合物(wu)經硫(liu)(liu)酸(suan)在加(jia)熱的(de)(de)條件下消化(hua)(hua)(hua)(hua)，硫(liu)(liu)酸(suan)的(de)(de)作用促使有機(ji)(ji)物(wu)脫(tuo)水炭化(hua)(hua)(hua)(hua)。含(han)(han)氮(dan)的(de)(de)有機(ji)(ji)物(wu)炭化(hua)(hua)(hua)(hua)并生(sheng)成(cheng)(cheng)碳(tan)，碳(tan)在將硫(liu)(liu)酸(suan)還原為二(er)氧化(hua)(hua)(hua)(hua)硫(liu)(liu)的(de)(de)反應(ying)中(zhong)，自身(shen)則被(bei)氧化(hua)(hua)(hua)(hua)成(cheng)(cheng)為二(er)氧化(hua)(hua)(hua)(hua)碳(tan)；反應(ying)過(guo)程(cheng)中(zhong)產生(sheng)的(de)(de)二(er)氧化(hua)(hua)(hua)(hua)硫(liu)(liu)將氮(dan)還原為氨(an)氣，此過(guo)程(cheng)中(zhong)其自身(shen)則被(bei)氧化(hua)(hua)(hua)(hua)成(cheng)(cheng)三(san)氧化(hua)(hua)(hua)(hua)硫(liu)(liu)；而(er)消化(hua)(hua)(hua)(hua)過(guo)程(cheng)生(sheng)成(cheng)(cheng)的(de)(de)氫，又加(jia)速了氨(an)的(de)(de)形(xing)成(cheng)(cheng)。生(sheng)成(cheng)(cheng)的(de)(de)水以水蒸氣的(de)(de)形(xing)式連(lian)同(tong)反應(ying)過(guo)程(cheng)中(zhong)生(sheng)成(cheng)(cheng)的(de)(de)三(san)氧化(hua)(hua)(hua)(hua)硫(liu)(liu)一同(tong)逸出，而(er)氨(an)氣則以硫(liu)(liu)酸(suan)銨的(de)(de)形(xing)式留在消化(hua)(hua)(hua)(hua)液(ye)中(zhong)。
化學反應方程(cheng)式為：
2NH2（CH2）2COOH＋13H2SO4→（NH4）2SO4＋CO2↑＋SO2↑＋16H2O
此(ci)(ci)過(guo)程的(de)(de)注意(yi)事項(xiang)：①樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)時(shi)(shi)(shi)，對于含糖量(liang)(liang)很高(gao)或含脂(zhi)量(liang)(liang)較多的(de)(de)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)，應(ying)注意(yi)要(yao)(yao)緩(huan)慢升溫加(jia)(jia)(jia)熱(re)，并隨時(shi)(shi)(shi)注意(yi)控制(zhi)加(jia)(jia)(jia)熱(re)的(de)(de)溫度(du)，避免(mian)產(chan)生大量(liang)(liang)泡(pao)沫(mo)噴(pen)出(chu)或噴(pen)濺到(dao)瓶(ping)壁(bi)上(shang)(shang)(shang)，造成樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)的(de)(de)損失。若(ruo)因加(jia)(jia)(jia)熱(re)溫度(du)不當，局(ju)部溫度(du)過(guo)高(gao)使(shi)(shi)消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)液(ye)(ye)噴(pen)濺到(dao)瓶(ping)壁(bi)上(shang)(shang)(shang)，應(ying)及時(shi)(shi)(shi)轉(zhuan)動(dong)凱氏定氮瓶(ping)將(jiang)(jiang)(jiang)濺到(dao)瓶(ping)壁(bi)上(shang)(shang)(shang)的(de)(de)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)液(ye)(ye)沖下(xia)(xia)(xia)，也可在樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)前加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)少量(liang)(liang)辛醇或液(ye)(ye)體石(shi)蠟，以減(jian)少泡(pao)沫(mo)的(de)(de)產(chan)生。②消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)時(shi)(shi)(shi)應(ying)不定時(shi)(shi)(shi)旋轉(zhuan)凱氏定氮瓶(ping)，將(jiang)(jiang)(jiang)附(fu)在瓶(ping)壁(bi)上(shang)(shang)(shang)的(de)(de)碳粒(li)沖下(xia)(xia)(xia)，使(shi)(shi)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)充(chong)分消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)。③若(ruo)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)難(nan)以消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)至(zhi)澄清透明的(de)(de)程度(du)，可將(jiang)(jiang)(jiang)凱氏定氮瓶(ping)從加(jia)(jia)(jia)熱(re)器上(shang)(shang)(shang)取下(xia)(xia)(xia)，待其中(zhong)(zhong)(zhong)溶(rong)液(ye)(ye)冷卻至(zhi)室溫后(hou)，向(xiang)消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)少量(liang)(liang)過(guo)氧(yang)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)氫，再繼續加(jia)(jia)(jia)熱(re)直至(zhi)消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)。④整個消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)過(guo)程中(zhong)(zhong)(zhong)硫(liu)酸的(de)(de)量(liang)(liang)要(yao)(yao)充(chong)足(zu)，以保證(zheng)樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)中(zhong)(zhong)(zhong)含氮有機化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)合物的(de)(de)消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)。樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)中(zhong)(zhong)(zhong)脂(zhi)肪含量(liang)(liang)過(guo)高(gao)時(shi)(shi)(shi)，要(yao)(yao)增加(jia)(jia)(jia)硫(liu)酸的(de)(de)量(liang)(liang)，因消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)時(shi)(shi)(shi)脂(zhi)肪消(xiao)(xiao)(xiao)耗硫(liu)酸的(de)(de)量(liang)(liang)較大，使(shi)(shi)硫(liu)酸缺少而影響測定。⑤在樣(yang)(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)末期，即消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)液(ye)(ye)呈藍綠色并澄清透明后(hou)，再繼續加(jia)(jia)(jia)熱(re)半小時(shi)(shi)(shi)即可，因此(ci)(ci)時(shi)(shi)(shi)瓶(ping)內消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)液(ye)(ye)溫度(du)過(guo)高(gao)，若(ruo)長時(shi)(shi)(shi)間加(jia)(jia)(jia)熱(re)，會使(shi)(shi)生成的(de)(de)硫(liu)酸氫銨分解并釋放出(chu)
氨氣，使(shi)氮的含量損失，從而(er)影響測定結果(guo)。
3、蒸餾
化學(xue)反應方程式為：
（NH4）2SO4＋NaOH→Na2SO4＋NH3↑＋H2O
注意事(shi)項：①水(shui)蒸(zheng)氣發生器(qi)中(zhong)(zhong)的(de)水(shui)要呈酸(suan)(suan)性(xing)，因水(shui)中(zhong)(zhong)可能(neng)含有(you)微量(liang)的(de)氨(an)(an)(an)離子，防止其受(shou)熱溢出(chu)而影(ying)響測(ce)(ce)定結果(guo)。②蒸(zheng)餾(liu)反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)過(guo)程(cheng)中(zhong)(zhong)，硫(liu)酸(suan)(suan)銨為(wei)強酸(suan)(suan)弱堿(jian)(jian)鹽，可使消化(hua)(hua)(hua)液(ye)(ye)為(wei)弱酸(suan)(suan)性(xing)溶(rong)液(ye)(ye)。為(wei)保證(zheng)測(ce)(ce)量(liang)結果(guo)的(de)準(zhun)確性(xing)，務必使結合態的(de)氨(an)(an)(an)能(neng)反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)并釋放(fang)出(chu)來，因此(ci)整個(ge)蒸(zheng)餾(liu)過(guo)程(cheng)中(zhong)(zhong)，堿(jian)(jian)液(ye)(ye)的(de)量(liang)不足，酸(suan)(suan)堿(jian)(jian)中(zhong)(zhong)和反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)則(ze)不，很難(nan)達到使氨(an)(an)(an)充分(fen)分(fen)離的(de)目的(de)，從而使測(ce)(ce)量(liang)結果(guo)不準(zhun)確。氫氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)鈉(na)溶(rong)液(ye)(ye)既能(neng)中(zhong)(zhong)和樣(yang)品消化(hua)(hua)(hua)液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)過(guo)量(liang)的(de)酸(suan)(suan)，又(you)可為(wei)氨(an)(an)(an)的(de)有(you)效分(fen)離提供一個(ge)堿(jian)(jian)性(xing)環境(jing)，因此(ci)氫氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)鈉(na)的(de)用(yong)量(liang)要控制適當(dang)。實驗者(zhe)可利用(yong)消化(hua)(hua)(hua)液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)含有(you)的(de)銅離子，根據(ju)其特征顏(yan)色(se)作(zuo)為(wei)堿(jian)(jian)性(xing)反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)的(de)指(zhi)示劑。當(dang)反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)室內加入氫氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)鈉(na)溶(rong)液(ye)(ye)后(hou)，其溶(rong)液(ye)(ye)顏(yan)色(se)立即變(bian)為(wei)藍黑(hei)色(se)時，表(biao)明氫氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)鈉(na)已過(guo)量(liang)，能(neng)達到酸(suan)(suan)堿(jian)(jian)反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)的(de)要求，可保證(zheng)反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)進(jin)行。③加氫氧(yang)(yang)化(hua)(hua)(hua)鈉(na)的(de)漏(lou)斗要采用(yong)水(shui)封，避(bi)免(mian)因蒸(zheng)餾(liu)裝置漏(lou)氣造成氨(an)(an)(an)的(de)溢出(chu)而影(ying)響測(ce)(ce)定結果(guo)。
4、滴(di)定(ding)
氨以(yi)氣(qi)體的(de)(de)(de)形式被釋(shi)放出(chu)來，用(yong)(yong)(yong)硼(peng)酸(suan)(suan)溶液吸收后，使(shi)用(yong)(yong)(yong)鹽(yan)酸(suan)(suan)或(huo)硫酸(suan)(suan)標(biao)準滴(di)(di)定(ding)(ding)液進行酸(suan)(suan)堿滴(di)(di)定(ding)(ding)，從而(er)計算(suan)出(chu)樣品中蛋白質(zhi)的(de)(de)(de)含(han)量。此(ci)過程的(de)(de)(de)注意事項：①硼(peng)酸(suan)(suan)吸收液的(de)(de)(de)溫度(du)不(bu)宜過高，過高則(ze)氨的(de)(de)(de)吸收能力將(jiang)(jiang)減弱，會影(ying)響(xiang)測量結果，使(shi)結果偏低(di)。方式是保持溶液溫度(du)在20℃以(yi)下，或(huo)將(jiang)(jiang)接(jie)收瓶置于冷(leng)水(shui)浴中。②硼(peng)酸(suan)(suan)吸收液的(de)(de)(de)體積不(bu)使(shi)用(yong)(yong)(yong)精密量取，只要(yao)(yao)保證能將(jiang)(jiang)氨全部吸收即可，因為硼(peng)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)酸(suan)(suan)性很弱，不(bu)會影(ying)響(xiang)滴(di)(di)定(ding)(ding)。③滴(di)(di)定(ding)(ding)用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)標(biao)準滴(di)(di)定(ding)(ding)液必須(xu)按照要(yao)(yao)求進行配制和標(biao)定(ding)(ding)，因其準確度(du)直接(jie)影(ying)響(xiang)測量結果的(de)(de)(de)準確性。④計算(suan)蛋白質(zhi)的(de)(de)(de)含(han)量時(shi)須(xu)乘以(yi)氮換算(suan)蛋白質(zhi)的(de)(de)(de)系數，一般食(shi)物為6。25。
5、小結
新(xin)鮮食(shi)(shi)(shi)品(pin)中(zhong)的(de)含(han)氮(dan)(dan)化合(he)物(wu)大都以(yi)(yi)(yi)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)為主體(ti)，所以(yi)(yi)(yi)檢(jian)驗(yan)食(shi)(shi)(shi)品(pin)中(zhong)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)含(han)量(liang)(liang)時，只限于測(ce)定(ding)(ding)總(zong)氮(dan)(dan)量(liang)(liang)，然后乘以(yi)(yi)(yi)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)換算系(xi)數6。25，即可(ke)得到蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)含(han)量(liang)(liang)。凱氏定(ding)(ding)氮(dan)(dan)法可(ke)用(yong)于所有(you)(you)動、植物(wu)食(shi)(shi)(shi)品(pin)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)含(han)量(liang)(liang)測(ce)定(ding)(ding)，因樣品(pin)中(zhong)常(chang)含(han)有(you)(you)核酸、生物(wu)堿(jian)等以(yi)(yi)(yi)及(ji)含(han)氮(dan)(dan)色(se)素等非蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)含(han)氮(dan)(dan)化合(he)物(wu)，所以(yi)(yi)(yi)該法測(ce)定(ding)(ding)結(jie)果為粗(cu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)含(han)量(liang)(liang)。筆者通過參加國(guo)家機構組織的(de)“食(shi)(shi)(shi)品(pin)中(zhong)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)測(ce)定(ding)(ding)”能(neng)(neng)力檢(jian)驗(yan)證，以(yi)(yi)(yi)反(fan)復實驗(yan)為基礎，在實驗(yan)過程中(zhong)摸索可(ke)能(neng)(neng)影響實驗(yan)結(jie)果的(de)關鍵點和注意事項，嚴格把握實驗(yan)原理，多次推敲與總(zong)結(jie)，得到上述(shu)實驗(yan)經驗(yan)。
參(can)考文獻
［1］馬(ma)丹。凱(kai)氏(shi)定氮法測定食品中蛋白質含(han)量［J］。計量與(yu)測試技術，2008，35（06）：57－58。
［2］王燕(yan)。食品檢(jian)驗技術(shu)（理化部(bu)分）［M］。1版。北京(jing)：中國輕工業出版社，2012：102－110。
［3］中(zhong)(zhong)(zhong)華人民共和國(guo)(guo)國(guo)(guo)家(jia)藥典(dian)委員會。中(zhong)(zhong)(zhong)國(guo)(guo)藥典(dian)［M］。1版。北京：中(zhong)(zhong)(zhong)國(guo)(guo)醫藥科技(ji)出版社，2010：53。
［4］張朝(chao)武。現(xian)代(dai)衛(wei)生檢驗［M］。1版。北(bei)京：人民衛(wei)生出版社，2005：24－56。
［5］中(zhong)國(guo)藥(yao)品生(sheng)物制品檢定所(suo)，中(zhong)國(guo)藥(yao)品檢驗總所(suo)。藥(yao)品檢驗儀器標準操作(zuo)規程(cheng)［M］。1版(ban)。北(bei)京：中(zhong)國(guo)醫藥(yao)科(ke)技出(chu)版(ban)社，2010：181－183。
歡迎來到濟南阿爾瓦儀器有限公司！
